Основные достижения и публикации

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ПО ПРОЕКТУ В 2017 ГОДУ

1. Исследование клональной структуры репертуаров опухоль-инфильтрирующих Т- и B-лимфоцитов при кожной меланоме человека

Проведено исследование клональной структуры репертуаров опухоль-инфильтрирующих Т- и B-лимфоцитов при кожной меланоме человека. Репертуары гипервариабельных (CDR3) фрагментов Т-клеточных рецепторов и антител экстрагированы из данных транскриптомного анализа TCGA (48+48 нт RNA-Seq) опухолей для 458 пациентов (human skin cutaneous melanoma, SKCM). Показано, что высокий уровень экспрессии иммуноглобулинов опухоль-инфильтрирующими В-лимфоцитами, высокий уровень клональности репертуаров тяжелых цепей таких иммуноглобулинов, а также высокая пропорция транскриптов изотипа IgG1 от всех транскриптов IGH в опухоли ассоциировались с большей продолжительностью жизни пациентов. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Biotechnology.

2. Сбор и молекулярное тестирование образцов высокодифференцированных опухолей щитовидной железы

В рамках исследования оценки эффективности иммунодиагностических методов в онкологии начата работа по сбору и молекулярному тестированию образцов высокодифференцированных опухолей щитовидной железы. В исследование включены 25 пациентов с опухолями щитовидной железы промежуточного риска. Проведен первый этап работы, включающий в себя сбор и первичную оценку собранного опухолевого материала.  Работа будет направлена на сравнительную оценку информативности двух методов дифференциальной диагностики опухолей щитовидной железы промежуточного риска, а именно молекулярного профилирования опухолевой ткани и иммунодиагностического профилирования сыворотки крови.

3. Создание банка образцов опухолей и крови пациентов для изучения клональности репертуаров ТКР

На образцах пациентов с раком толстого кишечника и мочевого пузыря отработаны ключевые методики для дальнейшей работы с материалом, получаемым от пациентов, в том числе: получение и сортировка субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови, получение и сортировка субпопуляций опухоль-инфильтрирующих Т лимфоцитов, забор образцов опухолей и метастазов для консервации ДНК, РНК и получения парафиновых блоков, выделение свободно циркулирующей ДНК крови. Собраны образцы для первых пациентов, планируется дальнейшая работа. Исследование направлено на определение клональной структуры для сортированных субпопуляций Т-лимфоцитов в опухоли и периферической крови пациентов с дополнительным молекулярно-генетическим и морфологическим анализом образцов опухоли.

4. Размножение и поддержание мышей разных линий (C57Bl/6, BALB/c, C57Bl/6-FoxP3-EGFP), в том числе ведение группы стареющих животных

Размножены и поддерживаются в достаточной для работы численности колонии мышей C57Bl/6, BALB/c, трансгенных мышей C57Bl/6-FoxP3-EGFP, особи которых были получены от проф. Александра Руденского. Регуляторные Т-клетки этой линии экпрессируют зеленый флуоресцентный белок EGFP, что позволяет сортировать эти клетки в интактном виде (без использования внутриклеточного окрашивания), что необходимо для получения качественной РНК. Всего в 2017 году в экспериментах было задействовано около 200 мышей, в том числе около 40 стареющих животных в возрасте более 1 года. Более 200 мышей подготовлено к экспериментам в первой половине 2018 года. Для минимизации вклада случайного генетического разнообразия каждая серия экспериментов проводится на близкородственных мышах, потомках одних родителей во втором поколении. Разработан протокол быстрого фенотипирования трансгенных FoxP3-EGFP мышей с помощью проточной цитометрии.

5. Разработка схем иммунотерапии антителами к ингибиторам контрольных иммунных точек

Протестированы различные схемы подкожного прививания опухолевых клеток лини B16F0, иммунотерапии и забора опухолевой ткани.  Выбрана оптимальная схема, при которой прививается 1 миллион клеток B16F0, опухоли растут на протяжении 8-9 дней (до 1-2 мм). Иммунотерапия проводится в течение 5 дней (схема зависит от выбранного моноклонального терапевтического антитела).  Резекция осуществляется на 15-16ый день при достижении размера опухоли 8-9 мм. При такой схеме достигается высокий процент приживаемости опухолей, эффективный отбор для иммунотерапии мышей, достоверно несущих опухоль, забор опухоли достаточного размера (содержащей порядка 2-4 тысяч регуляторных Т-лимфоцитов - малочисленной, лимитирующей эксперименты популяцией). Более того, опухоль не превышает критической массы, после которой возникают некротические очаги, и возрастает гетерогенность по структуре. Также отработана схема с двумя прививаемыми опухолями для изучения эффектов в формате «до» и «после» иммунотерапии на одних и тех же особях. Схема является рабочей, однако, требует большого расхода мышей и реактивов вследствие меньшей стабильности. Тем не менее, данная схема может быть использована на более поздних этапах работы.

6. Оптимизация выделения опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов

Опробованы различные подходы к выделению опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов, в том числе выделение с использованием позитивной селекции Т-клеток на магнитных частицах (CD45/CD90.2, Miltenyi), перколле либо градиенте перколла, или их сочетании. От выделения на перколле при рутинной работе с опухолевыми образцами мышей решено отказаться по причине потери фракции, обогащенной крупными, активированными Т-лимфоцитами, представляющими существенный интерес. Выбрана наиболее надежная и прямая схема выделения опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов: гомогенизация опухолевых тканей, инкубация в присутствие смеси ферментов Liberase TL и ДНКазы I, промывка, фильтрация через сито с ячейками 70 мкм, покраска антителами и сортировка на приборе FACSAriaIII. Тем не менее, протокол на основе градиентного центрифугирования в растворе перколла использовался на этапе работы с крупными некротическими мышиными опухолями и с образцами человеческих опухолей, для которых характерно исходно высокое содержание клеточных обломков и прочего “мусора”. 

Введена в строй модернизированная версия сортера FACSAria III, оснащенного всеми необходимыми лазерами, что заметно повысило качество и надежность работы. Проведены первые серии экспериментов с сортировкой CD8, CD4, Treg Т-лимфоцитов, а также B-лимфоцитов из B16F0 опухолей мышей, пролеченных и не пролеченных моноклональным терапевтическим антителом к CTLA-4. Ведется работа с набранным материалом РНК.

Показано, что репертуары Т-клеточных рецепторов, извлекаемые из данных транскриптомного анализа для сортированных популяций Т-лимфоцитов высоко-информативны и сопоставимы с поверхностным анализом репертуара с использованием таргетного секвенирования. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Biotechnology. В связи с этим подход RNA-Seq сортированных Т- и В-лимфоцитов рассматривается как альтернатива таргетному секвенированию репертуаров ТКР и антител, позволяющая как извлекать репертуары иммунных рецепторов, так и проводить сравнительный транскриптомный анализ популяций.

7. Использование EGFP как суррогатного антигена опухоли

Получены стабильно трансфицированные EGFP клетки линии CT26, проведенные через единичные клетки. Полученные моноклональные линии отличались высокой гомогенностью и стабильностью экспрессии EGFP и были задействованы для отработки модели, в которой EGFP используется как суррогатный антиген опухоли, и сортировка EGFP-специфичных Т-лимфоцитов проводится с помощью тетрамеров MHC, несущих наиболее иммуногенный пептид EGFP. После ряда безуспешных попыток детектировать EGFP-специфичные Т-лимфоциты в опухоли или селезенке мышей, несущих EGFP-содержащую опухоль, от данной модели было решено отказаться.

8. Отработка техники идентификации опухоль-специфичных Т-лимфоцитов

Успешно отработана схема сортировки живых, продуцирующих интерферон-гамма Т-лимфоцитов из опухоли, с использованием достаточно сложного в применении подхода – secretion assay. Получены образцы первой серии экспериментов. С использованием этого и ряда других подходов, мы планируем сформировать системную базу данных о спектре вариантов Т-клеточных рецепторов C57Bl/6, специфичных к меланоме B16F0. Такие данные будут высоко востребованы научным сообществом для самых различных исследований на модели B16F0, а также помогут нам в нашей работе отслеживать судьбу опухоль-специфичных CD4 и CD8 (а по возможности также Treg) Т лимфоцитов при иммунотерапии.

9. Подготовка к публикации статьи по результатам проведенной работы

По результатам анализа полученных данных опубликована статья, входящая в первый квартиль (Q1) научных журналов базы данных Web of Science:

Bolotin D.A., Poslavsky S., Davydov A.N., Frenkel F.E., Fanchi L., Zolotareva O.I., Hemmers S., Putintseva E.V., Obraztsova A.S., Shugay M., Ataullakhanov R.I., Rudensky A.Y., Schumacher T.N., Chudakov D.M. Antigen receptor repertoire profiling from RNA-seq data. Nature Biotechnology. 2017 Oct 11; 35(10) :908-911. doi: 10.1038/nbt.3979 (IF 42)

10. Оснащение лаборатории оборудованием, материалами и комплектующими для проведения исследований

С целью выполнения заявленных исследований за счет бюджетных средств гранта проведена закупка комплектующих, расходные материалы и лабораторные животные на общую сумму 16 300 934, 44 руб.: 1. источник лазерного излучения с длиной волны 405 нм к системе для сортировки клеток BD FACSAriaIII необходимый для выполнения задач по сортировке культур клеток; 2. химические реактивы для проведения сортировки клеточных культур и иммуногистохимических исследований; 3. культуральные среды и добавки для приготовления культур опухолевых клеток; 4. культуральный пластик для наращивания культуры опухолевых клеток; 5. линейные мыши для проведения экспериментов. За счет средств статьи «Прочие расходы, непосредственно связанные с проведением научного исследования» был приобретен источник бесперебойного питания необходимый для обеспечения стабильной работы системы сортировки клеток BD FACSAriaIII.

Для выполнения запланированных исследований за счет внебюджетных средств гранта было приобретено следующее оборудование на общую сумму 441 075 руб. и расходные материалы на общую сумму 773 137,17 руб.: 1. автоматический гомогенизатор тканей gentleMACS необходимый для автоматизации пробоподготовки при работе с тканями и получения суспензий отдельных клеток и тонких гомогенатов; 2. магнитный сепаратор MidiMACS необходимый для выделения исследуемого типа клеток из тканей и крови; 2. химические реактивы для проведения сортировки клеточных культур и иммуногистохимических исследований; 3. культуральные среды и добавки для приготовления культур опухолевых клеток; 4. культуральный пластик для наращивания культуры опухолевых клеток; 5. линейные мыши для проведения экспериментов.

11. Участие ведущего ученого и членов научного коллектива в конференциях, научных семинарах, симпозиумах

Члены творческого коллектива приняли участие в 4 международных и 2 российских конференциях. На базе лаборатории было проведено 10 семинаров, из них 10 с очным участием ведущего ученого.

12. Текущий ремонт лаборатории

Выполнен ремонт помещения для установки системы сортировки клеток BD FACSAria III (США) и рабочей станции к ней и проведения экспериментальных работ по сортингу культур клеток. Помещение было выделено НижГМА для Научной лаборатории геномики адаптивного противоопухолевого иммунитета Распоряжением ректора №74 от 25.11.2016 и находится по адресу: г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, д. 1, учебный корпус № 3, НИИ Биомедицинских технологий, цокольный этаж, ком. № 7.

Проведено техническое обслуживание и ремонт необходимого для проведения научного исследования оборудования, переданного организацией лаборатории.

Раздел 13. Получение образцов сортированных субпопуляций Т-лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии (на базе сторонней организации – ННГУ)

В рамках выполнения научного исследования был заключен договор с Федеральным государственным автономным образовательным учреждением высшего образования «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» (ННГУ им. Н.И. Лобачевского) и выполнена научно-исследовательская работа на тему «Получение образцов сортированных субпопуляций Т-лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии». Результаты представлены в приложении 1 Отчета ВУ.

ПУБЛИКАЦИИ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ВЫПОЛНЕНИЯ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Bolotin D.A., Poslavsky S., Davydov A.N., Frenkel F.E., Fanchi L., Zolotareva O.I., Hemmers S., Putintseva E.V., Obraztsova A.S., Shugay M., Ataullakhanov R.I., Rudensky A.Y., Schumacher T.N., Chudakov D.M. Antigen receptor repertoire profiling from RNA-seq data. Nature Biotechnology. 2017 Oct 11; 35(10) :908-911. doi: 10.1038/nbt.3979 (IF 42)